两个PCR片段的overlap 我现在需要将片段1(

　2017年04月03日发布

Overlap PCR开始几个循环模板本来就是当引物使用的,所以模板可以多加,1和2都加到100ng左右.

你没有告诉我1b(2a)的Tm,Overlap的前几个循环要考虑两个模板互补的Tm.你的退火温度太低了,特异性不够强（除非你的Taq酶对退火温度有特殊要求,这个我不知道）.

我的建议：前10个循环,用1a,1b,2b中最低的Tm做退火温度,适当延长退火时间.后25个循环用1a,2b中最低的Tm做退火温度,正常退火时间（和你Taq酶的要求有关）.你模板链长度不小,不要怕多加模板.

提示：

楼上说得很有道理。温度很低啊。

建议你先不要加引物，做10个循环（模板本身就是引物）。然后再加入引物1a和2b.

还有退火温度比TM低5度，40度那步不要。可以换成49度5个循环。你好，谢谢你的答案。那我在前面10个循环加酶吗？我看到网上有说不加酶。还有就是一共只做15个循环码？加酶。只做15循环肯定不够的。那我先做10个循环，然后加入1a,2b，再扩增49°25个循环，可以吗？先...

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试试把退火时间延长一些,看能不能把两条链连上.一般就是照着引物的Tm值做就可以的.

两个片段的大小不能太大.

中间重叠部分不能太短,至少要有20nt以上.30,40比较好.

其实就是PCR,做两次,把两段序列融合在一起,第一次PCR的时候,第一段序列的3'引物和第二段序列的5'引物要有一段互补区,然后用第一次PCR的产物做模板,第一段序列的5'引物和第二段序列的3'引物做引物,进行第二次扩增,形成融合序列,详见图示

只要目的片段位置正确无需去管引物及其二聚体的,结果可靠.

究竟是不是引物二聚体你从理论上就可以分析判断.

一般常见情况是引物加过量了,在溴酚蓝位置常见亮带,在这中情况下,你不需要理他,若需要漂亮图片（发论文）,2办法：可以减少引物加入量,同时稍微降低镁离子浓度；或者在保证底物不缺乏情况下,增加几个循环就可以消除引物带.

扩不出来应该是你的退火温度的问题.用不用高保真酶的区别就在于会不会在延长的时候出错.

你可以做一个梯度PCR,如果还是没有扩出来的,那就是你的药品问题了,buffer啊,dNTP啊,酶啊有问题、